谷胺酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）試劑盒說明書

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分光光度法 50 管/24 樣
正式測定前務必取2-3 個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義
GS（EC 6.3.1.2）主要存在于植物中，是生物體內(nèi)氨同化的關(guān)鍵酶之一，催化銨離子和谷氨
酸合成谷氨酰胺，不僅可以防止過多的銨離子對生物有毒性，而且谷氨酰胺也是氨的主要儲
存和運輸形式。
測定原理
GS 在ATP 和Mg2+存在下，催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺；谷氨酰胺進一步轉(zhuǎn)化為γ─
谷氨?；惲u肟酸，在酸性條件下與鐵形成紅色的絡合物；該絡合物在540nm 處有zui大吸
收峰，可用分光光度計測定。
所需的儀器和用品
可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸
餾水。
試劑的組成和配制
提取液：30mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：12mL×1 瓶，-20℃保存，如有沉淀，靜置10min，取上清待用。
試劑二：12mL×1 瓶，-20℃保存，如有沉淀，靜置10min，取上清待用。
試劑三：粉劑×2 瓶，-20℃保存。用時每瓶加入5mL 蒸餾水充分溶解待用。
試劑四：15mL×1 瓶，4℃保存。
樣本測定的準備
1、細菌、細胞或組織樣品的制備：
細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量
（104 個）：提取液體積（mL）為500~1000：1 的比例（建議500 萬細菌或細胞加入1mL 提
取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30 次）；
8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10 的比例（建議稱取約0.1g 組織，
加入1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、血清（漿）樣品：直接檢測。
測定步驟
1、 分光光度計預熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長至540nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 在EP 管中加入下列試劑：
試劑名稱（μL） 測定管 對照管
試劑一 400
試劑二 400
試劑三 175 175
樣本 175 175
混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）準確水浴30min
試劑四 250 250
混勻，靜置10min 后，5000g，25℃離心10min，取上清液測定540nm 處的吸光值A?！鰽=A
測定管-A 對照管。每個測定管需設一個對照管。
GS 活力單位的計算
1、血清（漿）GS 活性
單位定義：每mL 血清（漿）在每mL 反應體系中每min 使540 下吸光值變化0.01 定義為
一個酶活力單位。
計算公式：
GS（U/mL）=ΔA×V 反總÷V 樣÷0.01÷T =19×ΔA
2、組織、細菌或細胞GS 活性
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg 組織蛋白在每mL 反應體系中每min 使540nm 下吸光值變化0.01 定義
為一個酶活力單位。
GS（U/mg prot）＝ΔA×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷0.01÷T =19×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g 組織在每mL 反應體系中每min 使540nm 下吸光值變化0.01 定義為一個
酶活力單位。
GS（U/g 鮮重）＝ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =19×ΔA÷W
（3）按細菌或細胞密度計算
單位定義：每1 萬個細菌或細胞在每mL 反應體系中每min 使540nm 下吸光值變化0.01 定
義為一個酶活力單位。
GS（U/104 cell）＝ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =0.038×ΔA
V 反總：反應體系總體積，0.8mL； V 樣：加入樣本體積，0.14mL；V 樣總：加入提取液
體積，1 mL；T：反應時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；
500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。