上海信帆生物供應(yīng)：谷氨酰胺酶( GLS) 活性測(cè)定試劑盒！

谷氨酰胺酶(glutaminase, GLS) 活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)
分光光度法 50 管/48 樣
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
GLS（EC 3.5.1.2）存在于高等動(dòng)物和某些細(xì)菌以及植物根中，催化谷氨酰胺水解成谷氨酸和
氨，在氮素代謝中具有重要調(diào)控作用，尤其是調(diào)節(jié)游離氨含量和尿素代謝。
測(cè)定原理：
GLS 催化谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨，利用奈氏試劑檢測(cè)氨增加的速率，即可計(jì)算其酶
活性。
需自備儀器和用品：
臺(tái)式離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、1mL 玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽、冰和蒸
餾水。
試劑組成和配制：
試劑一×1 瓶，60 mL，4 ℃保存；
試劑二×1 瓶，20 mL，4 ℃保存；
試劑三×1 瓶，30 mL，常溫保存；
試劑四×1 瓶，10 mL，常溫保存；
試劑五×1 瓶，6 mL，常溫保存；
試劑六×1瓶，6 mL，常溫避光保存。
粗酶液提?。?br />1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量
（104 個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1 的比例（建議500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL 試
劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30 次）；
8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約0.1g 組織，
加入1mL 試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至420nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣品測(cè)定（在EP 中加入下列試劑）：
試劑名稱(chēng)（uL） 測(cè)定管 對(duì)照管
樣本 25
蒸餾水 25
試劑一 100 100
試劑二 400 400
混勻，37℃水浴1 小時(shí)
試劑三 525 525
混勻，8000 g，25℃離心10 min；取上清液，在EP 管中加入下列試劑
上清液 650 650
試劑四 150 150
試劑五 100 100
試劑六 100 100
混勻，420nm 處讀取吸光值A(chǔ)，計(jì)算ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管。對(duì)照管只要做一管
計(jì)算：
1、血清（漿）GLS 活性
單位定義：每mL 血清（漿）每小時(shí)催化谷氨酰胺生成1μmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。
GLS（μmol /min/mL）＝363.1×(ΔA-0.1301)÷T=363.1×(ΔA -0.1301)
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞GLS 活性
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位定義：每mg 蛋白質(zhì)每小時(shí)催化谷氨酰胺生成1μmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。
GLS（μmol /min /mg prot）＝363.1×(ΔA-0.1301)÷Cpr÷T=363.1×(ΔA -0.1301)÷Cpr。
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位定義：每g 組織每小時(shí)催化谷氨酰胺生成1μmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。
GLS（μmol /min /g 鮮重）＝363.1×(ΔA-0.1301)÷(W÷V 樣總) ÷T=363.1×(ΔA -0.1301)÷W。
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位定義：每1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每小時(shí)催化谷氨酰胺生成1μmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。
GLS（μmol /min /104 cell）＝363.1×(ΔA-0.1301)÷(500÷V 樣總)÷T =0.7262×(ΔA -0.1301)
V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1h；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：
樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。