1.ELISA簡介

ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡稱。自上世紀70年代初問世 以來，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用 于生物學和醫(yī)學科學的許多領(lǐng)域。

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。

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2.ELISA 的樣本實驗準備

在收集樣本前都必須有一個完整的計劃，必須清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定。對收集后當天就進行檢測的樣本，及時儲存在4℃?zhèn)溆?。對于隔天再檢測的樣本，及時分裝后凍存在-20℃?zhèn)溆?，有條件的，-70℃凍存?zhèn)溆?。標本應避免反復凍融?/span>

液體類標本: 包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細胞培養(yǎng)上清等。

A.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。

B.血漿：應根據(jù)標本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。

C.尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實行。

D.細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。

E.培養(yǎng)細胞：檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融或加入組織蛋白萃取試劑，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

F.組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩吮救诨笕匀槐３?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），或組織蛋白萃取試劑，用手工或勻漿器將標本勻漿化。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

G.標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.

H.不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

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3.ELISA試劑盒的實驗原理和操作簡介

A.檢測范圍：

B.使用目的：本試劑盒用于測定大鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中C反應蛋白(CRP)含量。

C.實驗原理:

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大鼠C反應蛋白(CRP)水平。用純化的大鼠C反應蛋白(CRP)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入C反應蛋白(CRP)，再與HRP標記的C反應蛋白(CRP)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的C反應蛋白(CRP)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中大鼠C反應蛋白(CRP)濃度。 

D.操作程序簡介：

4.結(jié)果計算

  以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。 

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